前言

大量流行病学研究标明，大气PM2.5污染与人体呼吸系统、心血管系统及癌症等疾病的入院率、发病率、死亡率密切相关[1, 2]。呼吸系统疾病如肺功能降低、哮喘发作、支气管炎症以及肺癌都与PM2.5暴露有关[3]。目前认为PM2.5对呼吸系统致病机制主要是炎性损伤和氧化应激[4, 5]。主要表现为组织生化成分改变以及炎症因子的释放，诱发炎症，严重而持久的炎症反应会增加肺组织的防御屏障负担，造成恶性循环，引起组织增生纤维化，导致肺部疾病的发生[6]。

目前不少具有抗炎、抗氧化作用的物质引入干预PM2.5损伤的研究，如大黄素、维生素E、番茄红素、黑巧克力、人参皂苷Rg[7-10]等。清肺抑火胶囊处方来源于明龚延贤《寿世保元》，属中医经典处方之一，由黄芩、栀子、天花粉、桔梗、知母、大黄、前胡、黄柏、苦参组成。具有清肺止咳，降火生津，对于呼吸系统疾病具有预防和治疗作用。受上海方心健康科技发展股份有限公司委托，本研究以大气PM2.5气管滴注染毒大鼠造成的肺损伤为模型，在染毒前后分别给药，探索清肺抑火胶囊对PM2.5染毒所致肺损伤的干预作用及其可能机制。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

Thermo Andersen大容量采样器，LGJ-10D型冷冻干燥机，超声波清洗机（Ultrasonic Cleaner），IL-1β试剂盒、IL-6 试剂盒、Hs-CRP试剂盒和TNF-α试剂盒来自Ebioscience生物技术有限公司；酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）试剂盒、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）试剂盒、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒、白蛋白（albumin，ALB）试剂盒、总蛋白（total protein，TP）试剂盒均来自南京建成生物工程研究所。清肺抑火胶囊由上海中药制药技术有限公司提供。

1.2 PM2.5的采集及其悬液的制备

2014年4-7月，于上海市某居住区附近设置采样点，其附近无工业企业，周围人口较密集。采样高度为16米。用Thermo Andersen 大容量采样器采集PM2.5于玻璃纤维滤膜上。将吸附PM2.5的滤膜剪成1cm*3cm大小浸入超纯水中，低温震荡30min*3次，洗脱PM2.5。将洗脱的PM2.5用6层纱布过滤，滤液真空冷冻干燥，-20℃保存备用。染毒前，用生理盐水制成实验所需浓度的PM2.5悬液，超声震荡10min混匀灭菌。

1.3大鼠染毒及处理

1.3.1 SPF级SD大鼠，购自上海西普尔－毕凯实验动物有限公司，雄性，体重180-200g，合格证号：2008001641248。大鼠购入后，在SPF饲养室内适应性喂养两天，饲养温度18-22℃，湿度为45%-55%，昼夜节律设计为12h昼夜交替。随机分为10组，每组6只。大鼠饲养时间为2014.06.18到2014.07.01，共计2周。大鼠气管滴注PM2.5悬浮液，染毒剂量为40mg/kg，隔天一次，共三次。清肺抑火胶囊每天同一时间段进行灌胃给药，连续给药1周。清肺抑火胶囊用0.2%缩甲基纤维素溶解。给药设低、中、高剂量分别为0.07g/kg·bw、0.33g/kg·bw、0.66g/kg·bw。

实验分组如下：

（1）PM2.5染毒前清肺抑火胶囊给药组（清肺抑火胶囊预防组）：清肺抑火胶囊低、中、高剂量分别连续灌胃给药一周（每日一次）后，给予PM2.5气管滴注染毒（隔天一次，共3次）；

（2）PM2.5染毒后清肺抑火胶囊给药组（清肺抑火胶囊治疗组）：PM2.5气管滴注染毒（隔天一次，共3次）后，清肺抑火胶囊低、中、高剂量连续灌胃给药1周（每日一次）；

（3）给药对照组：清肺抑火胶囊高剂量连续灌胃给药1周后（每日一次），正常饲养一周；

（4）空白对照组：正常饲养2周，连续灌胃给予2mL浓度为0.2%的羧甲基纤维素溶液一周（每日一次）；

（5）PM2.5染毒对照组1：动物正常饲养一周（不给予药物）后，再进行PM2.5染毒（隔天一次，共3次）；

（6）PM2.5染毒对照组2：动物先给予PM2.5气管滴注染毒（隔天一次，共3次），再正常饲养一周。

(7) 生理盐水对照组：动物先给予动物先给予生理盐水气管滴注染毒（隔天一次，共3次），再正常饲养一周。

1.3.2 肺脏支气管肺泡灌洗

每组取6只大鼠，用10%的水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉，腹主动脉抽血处死。结扎一侧肺的支气管，该侧肺用于肺病理检查取样，另一侧肺做肺灌洗。每次用37℃预温的生理盐水3ml灌洗另一侧肺叶，共灌洗3-4次，收集BALF至8ml，3000r/min离心20min，留取上清液，分装后于-80℃冰箱保存。细胞沉淀制成细胞悬液,做灌洗液细胞分类计数。

1.4 肺泡灌洗液中生化指标的测定

采用相应的试剂盒测定肺泡灌洗液中的ACP、AKP、LDH、ALB和TP，ELISA方法检测细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和Hs-CRP水平。严格按照试剂盒说明书的程序进行测定。包括：酸性磷酸酶（ACP）的测定（4-氨基安替吡啉法）、碱性磷酸酶（AKP）的测定（4-氨基安替吡啉法）、乳酸脱氢酶（LDH）的测定（2，4-二硝基苯肼比色法）、总蛋白（TP）的测定（考马斯亮蓝法）、白蛋白（ALB）的测定（溴甲酚绿法）和白介素-6（IL-6）的测定（ELISA法）。

应用双抗体夹心法测定肺泡灌洗液中的白细胞介素-6（IL-6）水平。用纯化的白细胞介素-6（IL-6）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入白细胞介素-6（IL-6），再与HRP标记的IL-6抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的白细胞介素-6（IL-6）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中白细胞介素-6（IL-6）含量。

1.4.7 肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1β、Hs-CRP的测定（ELISA法）

1.3.3 肺病理切片

取每只大鼠未灌洗一侧肺脏，置10%福尔马林固定液固定，制成石蜡切片，厚度为5um，用HE（苏木素-伊红）染色。光学显微镜下观察肺组织的病理改变。

1.4  统计学处理

所有数据均以表示，采用SPSS22.0软件包进行ANOVA方差分析。对各组数据分别进行各指标的方差分析，方差分析结果提示存在显著性差异后，再采用多重比较进行两两比较，多重比较采用LSD法，取P<0.05作为差异显著性水平。

2 结果

2.1 肺脏的病理学观察

2.1.1大鼠肺脏外观

空白对照组大鼠肺组织呈粉红色，表面有光泽质地柔软；PM2.5染毒对照组1和染毒对照组2的肺组织弹性变差，质地变硬，肺脏呈灰粉色，可见黑色颗粒物灶状沉积。清肺抑火胶囊预防组和治疗组的各剂量组肺组织外观表现较PM2.5染毒对照组1和染毒对照组2的有一定程度的改善。

2.1.2 光学显微镜镜下

空白对照组（图1A）、生理盐水对照组（图1B）肺组织切片仅见部分肺泡间隔增厚，肺泡腔内少量炎性细胞浸润，未见颗粒物聚积。PM2.5染毒对照组1 （图1C）和染毒对照组2 （图1G）的肺内，可见PM2.5颗粒聚积，多位于尘细胞和多核巨细胞内，呈圆形或椭圆形。肺泡间隔增厚及纤维增生，肺泡腔缩小，肺间质和肺泡腔内炎性细胞浸润。

药物预防低（图1D）、中（图1E）、高剂量组（图1F）中，药物预防低、中、高剂量组中，均可见少量颗粒物聚积，肺泡间隔稍微增厚，肺泡腔略缩小，肺间质炎性细胞浸润，其中高剂量组损伤症状最轻。各剂量组大鼠肺部损伤情况虽然不同，但均较PM2.5染毒对照组1损伤情况减轻。

药物治疗低（图1H）、中（图1I）、高剂量组（图1J）中，均可见少量颗粒物聚积，肺泡间隔稍微增厚，肺泡腔略缩小，肺间质炎性细胞浸润。大鼠肺部损伤情况不同，但均较治疗作用的PM2.5染毒对照组2损伤情况减轻。

图1 HE染色各大鼠肺病理观察

注:A:空白对照：B:生理盐水对照：C: PM2.5染毒对照组1：D:染毒前低剂量给药：E:染毒前中剂量给药：F:染毒前高剂量给药：G: PM2.5染毒对照组2：H:染毒后低剂量给药：I:染毒后中剂量给药：J:染毒后高剂量给药

2.2肺泡灌洗液中分类细胞计数

如表1所示，与空白对照组比较，给药对照组、生理盐水对照组大鼠肺泡灌洗液中的中性粒细胞百分比无显著性差异（p>0.05）。与空白对照组相比，PM2.5染