基因的图位克隆法、cDNA差示分析法克隆基因
日期:2012-07-25 来源: 阅读数:2700
据www.qgyyzs.net小编了解,在很多载体中都携带有一段来自大肠杆菌的lac操纵子dna区段,其中含有lacz基因,其编码β-半乳糖苷酶n-端的146个氨基酸,称为α-肽。载体转化的宿主细胞为lacz△15基因型,其表达β-半乳糖苷酶的c-端肽链,当载体与宿主细胞同时表达两个片段的时候,宿主细胞就具有半乳糖苷酶的活性,使得特异性的底物x-gal变为蓝色化合物,即α-互补。重组子由于基因插入使得α-肽基因失活,不能形成α-互补,在含有x-gal的平板上,含阳性重组子的细菌为无色菌落或者噬菌斑。这就是β-半乳糖酶筛选体系。
应用cdna差示分析法克隆基因。这种方法能够充分发挥pcr技术以指数形式扩增双链dna模板的性质,通过降低cdna群体复杂性和更换cdna两端接头等方法特异性扩增目的基因片段。因为试验对象(tester)和供试探针(driver)在接受差分分析前均经过一个4碱基切割酶的处理,形成平均长度256bp的代表群,保证绝大部分遗传信息被扩增。每次t减d反应后仅设置72℃复性与延伸,94℃复性这两个参数共二十个pcr循环,pcr产物的特异性和所得探针的纯度非常高。
基因的图位克隆法是分离未知性状目的基因的一种好方法,在理论上所有具有某种表现性基因都可以通过该方法克隆得到。将目的基因定位到某个染色体特定位点,在其两侧确定紧密连锁的rflp或rapd分子标记,通过分析找出最近的rflp标记,根据基因功能互作原理鉴定目的基因。
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