造血干细胞CFU(Colony Forming Unit)集落形成检测
日期:2022/10/19 8:39:52 阅读数:652
实验概要
造血干细胞CFU(Colony Forming Unit)集落形成检测
主要试剂
DPBS,HSCs培养液,MethoCult®培养基,HSCs稀释液
主要设备
离心机,超净台,体视镜,倒置显微镜,35 mm、100 mm培养皿,注射器,16号钝针头,移液器,涡旋仪,5 mL、10 mL移液管,离心管
实验步骤
1)将所需要的MethoCult®培养基在2-8℃过夜或室温融化。
(2)用16 号钝针头的注射器将培养基分装于流式管中(3.3ml/管)
(3)准备三个35 mm的培养皿,制备双份培养系统。具体方法如下:把两个35mm的带盖培养皿和一个盛有水的35mm无盖培养皿一起放置到100 mm的培养皿中。
(4)准备CD34 细胞,细胞计数仪计数后用0.3mlIMDM 2%FBS稀释细胞至10倍的接种终浓度。推荐细胞数是每个3.5 cm培养皿500~2000个细胞。然后把稀释后的细胞悬液按照1:10的比例加到MethoCult®培养基中
(5)将细胞转移到装有MethoCult®培养基的流式管后立刻剧烈涡悬振荡。然后静置5 min,使气泡消散。
(6)将无菌的16号钝端针头接到无菌的3mL注射器上,用注射器吸取MethoCult®培养基和细胞的混合物,每个3.5 cm培养皿中加入1.1mL,盖好盖子。每接种一支试管的混合物,用一套新的钝端针头和注射器。
(7)重复(5)-(6)中操作,将细胞接种到另外一个35 mm培养皿中。
(8)轻轻倾斜并旋转培养皿,使培养液在培养皿内铺满,并分布均匀。
(9)将接种好细胞的35 mm培养皿置于10 cm培养皿中,并在不盖盖子的35 mm培养皿中加入3 mL无菌水,把10 cm培养皿的盖子盖好。
(10)将培养皿置于CO2培养箱中,培养14~16天。
(11)经过14~16天的培养后,进行克隆计数。
在培养的不同时期取1×105个细胞进行CFU培养,随培养天数增加,CFU形成数量和种类都有所下降。
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